甲型流感病毒核酸檢測試劑盒的原理是通過擴增病毒基因組中的特定區(qū)域，將其轉(zhuǎn)化為可以檢測的數(shù)量級，并使用熒光探針或其他方法檢測擴增產(chǎn)物的存在與否。具體來說，該測試劑盒通常使用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)，利用逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒RNA轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的DNA，在PCR過程中，使用特異性引物擴增目標DNA序列，結(jié)合熒光探針進行實時熒光定量檢測。如果樣本中存在甲型流感病毒的DNA，則會產(chǎn)生熒光信號，證明樣品呈陽性結(jié)果。

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試劑組成：

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

儲存條件及有效期：

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過5次，有效期12個月。

適用儀器：

ABI、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。

標本采集：

適用于人體的血液、體液和棉拭子等多種樣本。

保存和運輸：

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復(fù)凍融。

甲型流感病毒核酸檢測試劑盒使用方法：

1.  樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1樣本前處理

血液、體液和棉拭子樣本取100μL于1.5mL滅菌離心管中。

1.2核酸提取

推薦采用上海研尊生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進行核酸提取， 請按照試劑說明書進行操作。

2.  試劑配制(試劑準備區(qū))

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照；反應(yīng)管數(shù)每滿10份，多配制1份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑CB反應(yīng)液酶液用量(樣本數(shù)為N) 20μL，1μL將混合好的測試反應(yīng)液分裝到PCR反應(yīng)管中，21μL/管。

3.  加樣(樣本處理區(qū))

將步驟1提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴增(核酸擴增區(qū))

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)。

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道(Reporter Dye)FAM， 淬滅通道(Quencher Dye)NONE，ABI系列儀器請勿選擇ROX參比熒光，選擇None即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)溫度時間收集熒光信號

1 1 cycle 95℃ 10min 否

2 40 cycles

94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.  結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道Ct值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑：檢測通道35值≤38，建議重復(fù)檢測，如果檢測通道仍為35值≤38，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。

6.  質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：Ct值>38或無Ct值；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤32；

以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

7. 檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

注意事項：

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，混勻并短暫離心；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進行處理。